· poliakrilamidaĠel magħmul minn monomeru tal-akrilamide, materjal tal-bidu tal-polimerizzazzjoni, katalist, u t-taħlita tal-melħ u l-buffer flimkien.
· akrilamideu l-BIS (N, N'-metilin akrilamide doppju) hija l-matriċi tal-ġell f'forma ta' monomeru.
· l-ammonju persulfat jibda l-proċess tal-polimerizzazzjoni tal-adeżiv. Il-formulazzjoni tal-kolla teħtieġ soluzzjoni ta' 10% ammonju persulfat ippreparata fl-ilma. Il-biċċa l-kbira tal-informazzjoni indikat il-ħtieġa għal użu attiv. Madankollu, is-soluzzjoni ta' 10% tista' titqiegħed f'4℃ għal diversi ġimgħat mingħajr telf sinifikanti ta' attività. Żid sa 10 ml u armiha meta l-kolla tonqos milli tgħaqqad.
Ħjiel: Il-perċentwal ta'akrilamideFis-sekwenzar, il-kolla u l-kolla tal-proteini mhumiex l-istess. Jekk tuża soluzzjoni ta' acrylamide: BIS magħmula minn qabel, kun żgur li tieħu l-flixkun it-tajjeb.
· TEMED (N, N, N', N'- tetramethyl ethylenediamine) huwa katalist, fi flixkun kannella, imqiegħed fil-friġġ. Żid eżatt qabel ma tferra l-kolla.
· Il-ħġieġ użat fl-elettroforesi tal-poliakrilamida għandu jinħasel qabel u wara kull darba. Wara l-elettroforesi, aħsel b'pinzell artab u drapp f'ilma sħun bis-sapun, laħlaħ b'ilma distillat u ħallih jinxef.
· L-umdità u t-trab jistgħu jikkawżaw ħsara lill-polimeru vojt. Qabel l-elettroforesi, naddaf il-pjanċa tal-ħġieġ b'tindif tal-ħġieġ u imsaħha b'pinzell artab. Aħsel b'ilma distillat u nixxef sewwa b'karta. It-tlaħliħ b'70% etanol qabel timsaħ bil-karta jgħin biex jitnaddaf u jitħaffef it-tnixxif. Żid kampjuni ta' acrylamide suċċessivament: BIS, ilma, soluzzjoni buffer, ammonium persulfate, TEMED. Ħawwad sew u ferra immedjatament.
Mhuwiex neċessarju li l-poliakrilamida titneħħa l-gass qabel il-polimerizzazzjoni. (L-akrilamida kienet titqiegħed f'vakwu biex jitneħħew il-bżieżaq għax l-ossiġnu jinibixxi l-polimerizzazzjoni.)
Kampjuni ta' ponot orizzontali għall-kolla.
· poġġi biċċa karta sewda fil-kaxxa tal-qiegħ, bi sfond iswed biex tagħmel xi toqba għall-kampjun biex tara b'mod aktar ċar.
· buffer mimli tank tal-kolla, eżatt fuq il-kollojde.
· jekk it-tarf għandu dawl, ixgħel id-dwal, ħalli d-dawl jiddi kollojdali. Iġbed il-kampjun fil-pipetta.
· bl-użu ta' apparat awtomatiku għall-pipettar.
· f'10-200 mu punt wieħed li jiċċaqlaq il-likwidu jista' jintuża fil-biċċa l-kbira tal-punti fuq il-kampjun. Għal toqob żgħar ħafna fil-kampjun (inqas minn 10μ1), ir-ras twila tal-pipetta użata għall-kolla tas-sekwenzar hija aktar konvenjenti.
· pipettaġġ billi tkun mgħaddas fil-kampjun, u tieħu nifs ta' fluwidu li jiċċaqlaq bil-mod. Il-kampjun jista' jidher li jwaħħal bil-gliċerina, u l-ippumpjar mgħaġġel jista' jiġbed bżieżaq tal-arja fir-ras tal-pipetta.
· Il-kampjuni wara li tieħu n-nifs bir-ras tal-pipetta, ir-ras tal-fluwidu se tiċċaqlaq bil-mod mat-tarf tal-pajp jew billi timsaħ il-karta, ir-ras tal-likwidu se tiġi ġbda 'l barra mill-qtar. Oqgħod attent li ma tiġbidx il-kampjun.
Poġġi l-kampjun fit-toqba tal-kampjun
· apparat tal-pipettar biex iżomm ftit pressjoni, iġiegħel il-kampjuni jiċċaqalqu ftit fir-ras tal-likwidu li jfur.
· ir-ras tal-pipetta mdaħħla fil-buffer, ftit ogħla mit-toqob tal-post, iżżomm pressjoni pożittiva. Il-ponta tal-pipetta tista' tiddaħħal f'toqba żgħira.
· bil-mod u b'mod kostanti oħroġ il-kampjuni 'l barra. Il-ponta tal-pipetta titqiegħed 'il fuq mit-toqba tal-kampjun, u l-kampjun jegħreq fit-toqba. Ħalli l-kampjun jegħreq biex jimla t-toqba tal-kampjun minflok ma timbotta 'l ġewwa.
· ladarba l-aħħar qatra tal-kampjun b'ras likwida, il-likwidu jiċċaqlaq għat-tieni sieq, għolli bil-mod il-moviment tal-likwidu, joħroġ mill-bafer
Kif tagħmel teħid ta' kampjuni tal-kolla vertikali?
· toqob tal-kampjun b'punt ta' kolla vertikali ffurmati bejn żewġ biċċiet ħġieġ. F'kolla rqiqa ħafna, ir-ras tal-pipetta lanqas biss tista' tiddaħħal bejn żewġ pjanċi tal-ħġieġ. Oqgħod attent għall-gliċerina! Poġġi r-ras tal-pipetta fuq it-toqba tal-kampjun u l-kampjun se jegħreq fit-toqba.
· Qabel ma tieħu l-kampjun, kun żgur li tpoġġi l-punt vertikali fuq it-toqba tal-kampjun tal-ġell tal-polipropilene acyl tkun tlaħlaħ sew. Aħsel l-acrylamide mhux polimerizzat u l-ilma li jista' jidher fil-qiegħ tat-toqba tal-kampjun. L-ilma jista' jagħmel it-toqba tal-kampjun ferm iżgħar. Uża siringa ta' 25ml jew 50ml u labra ta' 18-gauge. Ferra l-buffer tal-elettroforesi u laħlaħ bir-reqqa t-toqba tal-kampjun.
· jista' jkun diffiċli li tara t-toqba tal-kampjun, iżda fl-istess ħin, il-bqija huwa faċli. Jekk ikun hemm toqob żejda, il-buffer tal-kampjun jista' jiġi ttestjat bil-bromophenol blue.
Ħin tal-posta: 31 ta' Marzu 2023