Prekawzjonijiet għall-elettroforeżi tal-ġel tal-polyacrylamide

· PolyacrylamideIl-ġel irid permezz ta 'monomeru ta' l-akrilamide, materjal tal-bidu ta 'polimerizzazzjoni, katalist, u l-lemin ta' melħ u taħlita ta 'buffer flimkien.

· acrylamideu bis (N, N '- Methylene double acrylamide) hija l-forma tal-ġel tal-forma monomeru.

· Il-persulfat tal-ammonju jibda proċess ta 'polimerizzazzjoni li jwaħħal. Il-formulazzjoni tal-kolla teħtieġ 10% soluzzjoni ta 'persulfat ta' l-ammonju mħejjija fl-ilma. Ħafna mill-informazzjoni indikaw ħtieġa għal użu attiv. Madankollu, is-soluzzjoni ta '10% tista 'titpoġġa f'4 ℃ għal bosta ġimgħat mingħajr telf sinifikanti ta' attività. Agħmel sa 10 ml u armi meta l-kolla tonqos milli tiġbor.

Tip: Il-persentaġġ ta 'acrylamideFis-sekwenzar tal-kolla u l-kolla tal-proteina mhumiex l-istess. Jekk tuża Acrylamide Premade: BIS Soluzzjoni, kun żgur li tikseb il-flixkun it-tajjeb.

· Temped (n, n, n ', n' - tetramethyl ethylenediamine) huwa katalist, fi flixkun kannella, imqiegħed fil-friġġ. Żid eżatt qabel tferra l-kolla.

· L-elettroforeżi tal-polyacrylamide użata fl-elettroforeżi għandha tinħasel qabel u wara kull darba. Wara l-elettroforeżi, aħsel b'pinzell artab u drapp f'ilma tas-sapun sħun, laħlaħ b'ilma distillat u toqgħod tinxef.

· L-umdità u t-trab jistgħu jikkawżaw bil-polimeru vojt. Qabel l-elettroforeżi, naddaf il-pjanċa tal-ħġieġ bil-ħġieġ li jnaddaf u imsaħha b'pinzell artab. Aħsel b'ilma distillat u nixxef sewwa b'arma tal-karta. It-tlaħliħ b'70% etanol qabel ma timsaħ bil-karta tgħin biex tnaddaf u tħaffef it-tnixxif. Żid kampjuni ta 'acrylamide suċċessivament: bis, ilma, soluzzjoni buffer, persulfat tal-ammonju, temed. Ħawwad sew u ferra immedjatament.

Mhux meħtieġ li titneħħa l-poliakrilamide qabel il-polimerizzazzjoni. (Acrylamide użat biex jitqiegħed f'vakwu biex jitneħħa l-bżieżaq minħabba li l-ossiġenu jinibixxi l-polimerizzazzjoni.)

Għajnuniet tal-kampjun tal-punt tal-kolla orizzontali.

· Poġġi biċċa karta sewda fil-kaxxa tal-qiegħ, sfond iswed biex tagħmel xi toqba tal-kampjun biex tara b'mod aktar ċar.
· Tank tal-kolla mimli buffer, eżatt fuq il-kollojde.
· Jekk it-tarf ikollu dawl, ixgħel id-dwal, ħalli d-dawl jiddi. Pinġi l-kampjun fil-pipetta.
· Uża apparat awtomatiku tal-pipetting.
· F'10-200 mu 1 punt li jiċċaqlaq likwidu jista 'jintuża f'ħafna mill-punti fuq il-kampjun. Għal toqob żgħar ħafna tal-kampjun (inqas minn 10μ1), ir-ras tal-pipetta twila użata għas-sekwenzar tal-kolla hija iktar konvenjenti.

· Pipetting biss mgħaddas fil-kampjun, li jinġibed fluwidu li jiċċaqlaq bil-mod. Il-kampjun jista 'jidher li jwaħħal mal-gliċerina, u l-ippumpjar rapidu jista' jiġbed bżieżaq ta 'l-arja fir-ras tal-pipetta.

· Kampjuni wara li tinġibed ir-ras tal-pipetting, se timxi ras fluwidu bil-mod fuq it-tarf tal-pajp jew timsaħ il-karta terda ras likwida barra mill-qtar. Oqgħod attent li ma terdax il-kampjun.

Poġġi l-kampjun fit-toqba tal-kampjun

· Apparat tal-pipetti biex iżomm ftit pressjoni, agħmel il-kampjuni li jiċċaqalqu ftit ras likwidu.
· Ir-ras tal-pipetti mdaħħla fil-bafer, kemmxejn ogħla mit-toqob tal-post, iżżomm pressjoni pożittiva. Il-ponta tal-pipetta tista 'tiddaħħal f'toqba żgħira.
· Bil-mod u b'mod kostanti l-kampjuni barra. Il-ponta tal-pipetta titqiegħed 'il fuq mit-toqba tal-kampjun tal-punt, u l-kampjun jinżel fit-toqba. Ħalli l-kampjun jegħreq biex timla t-toqba tal-kampjun minflok timbotta.
· Ladarba l-aħħar qatra ta 'kampjun b'ras likwidu, il-likwidu jimxi fit-tieni leg, bil-mod jgħolli l-mossa tal-likwidu, imxi' l barra mill-buffer

Kif tagħmel kampjunar tal-kolla vertikali?

· Toqob tal-kampjun tal-punt tal-kolla vertikali ffurmati bejn żewġ biċċiet tal-ħġieġ. Fil-kolla rqiqa ħafna, ir-ras tal-pipetta lanqas biss tista 'tiddaħħal bejn żewġ pjanċi tal-ħġieġ. Ara l-gliċerina! Poġġi r-ras tal-pipetta fuq it-toqba tal-kampjun u l-kampjun se jegħreq fit-toqba.
· Kampjun tal-punt qabel, kun żgur li tpoġġi l-punt vertikali tat-toqba tal-kampjun tal-ġel tal-polypropylene li tlaħlaħ. Aħsel l-akrilamide mhux polimerizzat u l-ilma li jista 'jidher fil-qiegħ tat-toqba tal-kampjun. L-ilma jista 'jagħmel it-toqba tal-kampjun sinifikament iżgħar. Uża siringa ta '25ml jew 50ml u labra ta' 18-il gauge. Ferra fil-bafer tal-elettroforeżi u laħlaħ bir-reqqa t-toqba tal-kampjun.
· Jista 'jkun diffiċli li tara t-toqba tal-kampjun, iżda fl-istess, il-bqija huwa faċli. Jekk ikun hemm toqob żejda, il-buffer tal-kampjun jista 'jiġi ttestjat bil-bromofenol blu.