Prekawzjonijiet għall-elettroforesi tal-ġel tal-polyacrylamide

· poliakrilammidġel għandu mill-monomeru akrilammid, materjal tal-bidu tal-polimerizzazzjoni, katalizzatur, u d-dritt ta 'melħ u taħlita buffer flimkien.

· akrilammidu BIS (N, N '- methylene double acrylamide) hija l-matriċi tal-ġel tal-forma tal-monomeru.

· ammonju persulfate bidu proċess ta ' polimerizzazzjoni kolla. Il-formulazzjoni tal-kolla teħtieġ soluzzjoni ta '10% ammonju persulfate ippreparata fl-ilma. Ħafna mill-informazzjoni indikat ħtieġa għal użu attiv. Madankollu, is-soluzzjoni ta '10% tista' titqiegħed f'4℃ għal diversi ġimgħat mingħajr telf sinifikanti ta 'attività. Żid sa 10 ml u armi meta l-kolla tonqos milli tgħaqqad.

Tip: Il-persentaġġ taakrilammidfis-sekwenzjar kolla u kolla proteina mhix l-istess. Jekk tuża acrylamide premade: soluzzjoni BIS, kun żgur li tikseb il-flixkun it-tajjeb.

· TEMED (N, N, N ', N '- tetramethyl ethylenediamine) huwa katalizzatur, fi flixkun kannella, imqiegħed fil-friġġ. Żid eżatt qabel tferra kolla.

· elettroforesi tal-polyacrylamide ħġieġ użat fl-elettroforesi għandu jinħasel qabel u wara kull darba. Wara l-elettroforeżi, aħsel b'pinzell artab u drapp f'ilma sħun bis-sapun, laħlaħ b'ilma distillat u toqgħod tinxef.

· umdità u trab jistgħu jikkawżaw b'polimeru vojt. Qabel l-elettroforeżi, naddaf il-pjanċa tal-ħġieġ b'apparat li jnaddaf il-ħġieġ u imsaħha b'pinzell artab. Aħsel bl-ilma distillat u nixxef sewwa b'imsaħ tal-karta. It-tlaħliħ b'70% etanol qabel ma timsaħ bil-karta jgħin biex jitnaddaf u jitħaffef it-tnixxif. Żid kampjuni ta 'acrylamide suċċessivament: BIS, ilma, soluzzjoni buffer, persulfat ta' l-ammonju, TEMED. Ħawwad sew u ferra immedjatament.

Mhuwiex meħtieġ li titneħħa l-gass tal-polyacrylamide qabel il-polimerizzazzjoni. (L-akrylamide kien jitqiegħed fil-vakwu biex jitneħħew il-bżieżaq minħabba li l-ossiġnu jinibixxi l-polimerizzazzjoni.)

Tips tal-kampjuni tal-punt tal-kolla orizzontali.

· poġġi biċċa karta sewda fil-kaxxa tal-qiegħ, sfond iswed biex tagħmel xi toqba tal-kampjun biex tara b'mod aktar ċar.
· tank tal-kolla mimli buffer, ftit fuq il-kollojde.
· jekk it-tarf ikollu dawl, ixgħel id-dwal, ħalli d-dawl jiddi kollojde. Iġbed il-kampjun fil-pipetta.
· bl-użu ta 'apparat awtomatiku ta' pipetta.
· f'10-200 mu 1 punt li jiċċaqlaq likwidu jista 'jintuża f'ħafna mill-punti fuq il-kampjun. Għal toqob tal-kampjuni żgħar ħafna (inqas minn 10μ1), ir-ras tal-pipetta twila użata għall-kolla tas-sekwenza hija aktar konvenjenti.

· pipetta biss mgħaddsa fil-kampjun, inaling fluwidu li jiċċaqlaq bil-mod. Il-kampjun jista 'jidher li jwaħħal mal-gliċerina, u l-ippumpjar rapidu jista' jiġbed bżieżaq tal-arja fir-ras tal-pipetta.

· kampjuni wara li jiġbdu l-pipetta tar-ras, se jimxu ras fluwidu bil-mod fuq it-tarf tal-pajp jew timsaħ karta terda ras likwidu barra tal-qtar. Oqgħod attent li ma terdax il-kampjun.

Poġġi l-kampjun fit-toqba tal-kampjun

· apparat ta 'pipetta biex iżżomm ftit pressjoni, tagħmel il-kampjuni ftit jimxu ras likwidu overflow.
· ir-ras tal-pipetta mdaħħla fil-buffer, kemmxejn ogħla mit-toqob tal-post, żomm pressjoni pożittiva. Il-ponta tal-pipetta tista 'tiddaħħal f'toqba żgħira.
· bil-mod u stabbli l-kampjuni barra. Il-ponta tal-pipetta titqiegħed 'il fuq mit-toqba tal-kampjun tal-punt, u l-kampjun se jegħreq fit-toqba. Ħalli l-kampjun jegħreq biex timla t-toqba tal-kampjun minflok timbotta 'l ġewwa.
· ladarba l-aħħar qatra tal-kampjun b'ras likwida, il-likwidu jimxi lejn it-tieni sieq, jgħolli bil-mod il-moviment tal-likwidu, iċċaqlaq mill-buffer

Kif tagħmel kampjunar tal-kolla vertikali?

· toqob vertikali tal-kampjun tal-punt tal-kolla ffurmati bejn żewġ biċċiet tal-ħġieġ. F'kolla rqiqa ħafna, ir-ras tal-pipetta lanqas biss tista 'tiddaħħal bejn żewġ pjanċi tal-ħġieġ. Ara l-gliċerina! Poġġi r-ras tal-pipetta fuq it-toqba tal-kampjun u l-kampjun se jegħreq fit-toqba.
· punt kampjun qabel, kun żgur li tpoġġi l-punt vertikali tal-polypropylene acyl gel kampjun toqba hija mlaħalħa nadif. Aħsel l-akrilammid mhux polimerizzat u l-ilma li jista’ jidher fil-qiegħ tat-toqba tal-kampjun. L-ilma jista 'jagħmel it-toqba tal-kampjun iżgħar b'mod sinifikanti. Uża siringa ta' 25ml jew 50ml u labra ta' 18-il gauge. Ferra l-buffer tal-elettroforeżi u laħlaħ bir-reqqa t-toqba tal-kampjun.
· jista 'jkun diffiċli biex tara t-toqba tal-kampjun, iżda fl-istess, il-bqija huwa faċli. Jekk ikun hemm toqob żejda, il-buffer tal-kampjun jista 'jiġi ttestjat bil-bromophenol blue.